文章题目：Sulfated galactans from Gracilaria corticata reprogram metabolism, activate Immunity, promote regeneration, and exhibit anti-melanoma activity

发表期刊：iScience

影响因子：4.7（JCR2025）

通讯单位：塔林大学；爱沙尼亚国家化学物理与生物物理研究所；斯里兰卡海洋大学；爱沙尼亚生命科学大学

        硫酸化多糖是红藻中一类重要的生物活性大分子，以琼脂和卡拉胶为代表的半乳聚糖因其独特的结构多样性而备受关注。红藻Gracilaria属是全球琼脂工业的基石，贡献了超过65%的琼脂产量，其硫酸化半乳聚糖已被证实具有抗氧化、抗菌、免疫调节和抗炎等多种活性。然而，这些多糖的结构特征如何转化为具体的生物学效应，其分子机制仍未被系统阐明。近年来，代谢组学研究揭示，硫酸化多糖的生物活性不仅依赖于受体结合，还通过重编程靶细胞内的氨基酸和脂质代谢来实现功能调控。基于此，作者以斯里兰卡沿海采集的红藻Gracilaria corticata为材料，通过冷/热分步提取获得6个琼脂型硫酸化半乳聚糖组分，结合结构表征、功能评价和靶向代谢组学分析，系统揭示了提取方式决定多糖结构、进而调控不同细胞类型代谢重编程的构效关系，为海洋多糖在免疫调节、组织再生和肿瘤治疗中的应用提供了新的理论框架。

        首先，作者对Gracilaria corticata（GC）进行分步冷/热水提取，结合乙醇沉淀获得6个硫酸化半乳聚糖组分，并对其理化性质和结构特征进行了系统表征。提取率结果显示（图1A），6个组分的得率在1.25%~4.94%之间，其中GC-1B（4.94%）和GC-2B（3.97%）得率最高。凝胶排阻色谱分析（图1B）显示，各组分在有无NaCl条件下呈现不同的洗脱行为，反映了其分子大小和电荷特性的差异。分子量测定揭示了明显的冷热提取差异：冷水组分GC-1A和GC-1B的分子量分别为100 kDa和900 kDa，而热水组分GC-2A、GC-2B和GC-3B普遍达到1160~1280 kDa的高分子量范围，仅有GC-3A例外。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析（图1D）证实所有组分均呈现典型的琼脂型半乳聚糖特征：3365~3393 cm⁻¹处的羟基伸缩振动、931~932 cm⁻¹处的3,6-内醚半乳糖特征峰、1224~1230 cm⁻¹处硫酸酯S=O伸缩振动，以及842~889 cm⁻¹处的C-O-S弯曲振动。总糖、硫酸根、蛋白和酚类组成分析（图1E）显示，各组分硫酸根含量在0.76%~12.04%之间，其中GC-1B硫酸化程度最高；总酚含量以GC-2A最高。NMR分析（图1F-I）进一步确认了D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖的交替骨架结构，并检测到6-O-甲基-D-半乳糖、丙酮酸缩酮化D-半乳糖以及C-4位硫酸化等取代修饰。值得注意的是，尽管结构组成差异显著，但各组分的抗凝血活性并无统计学差异，提示抗凝血活性可能取决于更精细的结构特征而非简单的硫酸根含量。

图1 红藻GC多糖的理化性质与结构表征

        接着，作者在RAW264.7巨噬细胞和人真皮成纤维细胞（HDF）中评价了GC多糖的免疫调节与促增殖活性。巨噬细胞活力实验（图2A）表明，所有4个测试组分在0.01~0.5 μg/μL浓度范围内均无细胞毒性，且呈现剂量依赖性的促增殖趋势，其中GC-2A和GC-3A活性最强，0.5 μg/μL时细胞活力分别达168.0%和169.2%。增殖实验（图2B）进一步验证了时间依赖性效应：24 h时热水组分GC-2A和GC-3A显著促进增殖，冷水组分GC-1B也有明显效果；48 h时所有组分均显著增殖，GC-1B增殖率最高达169.3%；72 h时GC-1B仍保持强增殖活性，而热水组分GC-2A和GC-3A则出现细胞活力大幅下降，提示热水组分对巨噬细胞呈现先促增殖后细胞毒的双相效应。一氧化氮（NO）生成实验（图2C）显示，冷水组分GC-1A和GC-1B能显著诱导巨噬细胞NO产生，分别为对照组的6.5倍和9.5倍，表明冷水组分具有强烈的经典免疫激活作用；而热水组分GC-2A的NO诱导作用较弱，与LPS阳性对照相当，提示其免疫激活模式不同。吞噬活性实验（图2D）进一步证实了这一分化：GC-1B和GC-1A显著增强吞噬功能，分别提高42%和29%；而GC-2A反而抑制吞噬活性，呈现增殖与功能解偶联的特征。显微镜观察（图2E）可见GC-2A处理72 h后巨噬细胞形态发生明显改变。HDF细胞活力实验（图2F）显示，GC-1A、GC-1B和GC-2A在测试浓度范围内均无细胞毒性，GC-2A还呈现出一定的促代谢增强趋势；仅GC-3A在部分浓度下表现出轻度毒性。总体而言，冷水组分对巨噬细胞表现为持续安全的免疫激活，热水组分则呈现先强促增殖后代谢耗竭的双相效应。

图2 GC多糖对巨噬细胞和成纤维细胞的活性评价

        随后，作者进一步考察了GC多糖对角质形成细胞（HaCaT）活力、增殖、迁移及细胞因子表达的影响。细胞活力实验（图3A）揭示了复杂的组分依赖性差异：GC-1A和GC-1B在低浓度下表现出显著毒性，而高浓度反而耐受性更好，呈现反常的浓度效应关系；GC-2A的安全性最佳，仅在0.03 μg/μL时有轻度降低，最高剂量0.5 μg/μL时活力仍达103.6%；GC-3A则在多个浓度下均表现出较明显的细胞毒性。增殖实验（图3B）显示了时间依赖性的促增殖效应：24 h时无显著变化，48 h时GC-2A和GC-3A显著增强增殖，72 h时所有组分均呈现强增殖活性，GC-2A效果最为突出，提示GC-2A可能通过激活渐进性增殖通路或自分泌信号环路发挥作用。体外划痕实验（图3C）证实GC-2A能显著促进HaCaT细胞迁移，加速伤口闭合，这一再上皮化促进效应与其促增殖作用一致。基因表达分析显示，24 h时（图3D）GC-2A对TNF-α有中度上调，但远低于LPS阳性对照；到48 h时（图3E），GC-2A处理组TNF-α表达显著下调，同时TGF-β1大幅上调，MMP-1几乎完全被抑制，IL-8也被显著压制。

图3 GC多糖对角质形成细胞活力、增殖、迁移及细胞因子表达的影响

        在B16-F10黑色素瘤细胞中，作者系统评价了GC多糖的选择性抗肿瘤活性。细胞活力实验（图4A）显示，GC-1A在所有测试浓度下均无明显毒性，GC-1B仅在中低浓度有轻度抑制，而热水组分GC-2A和GC-3A表现出剂量依赖性的抗增殖活性，其中GC-3A效果最强，0.02 μg/μL时细胞存活率降至72.94%。增殖实验（图4B）的时间动力学分析表明，24 h时无显著变化，48 h时所有组分均出现不同程度的增殖抑制，72 h时GC-2A仍维持显著抑制，显示出持续的抗肿瘤效应。细胞迁移实验（图4C）进一步发现，能促进正常皮肤细胞迁移的GC-1A和GC-2A，反而抑制B16-F10黑色素瘤细胞的迁移扩散，这种双向选择性具有重要的临床价值。显微镜形态观察（图4D）显示，GC多糖处理后黑色素瘤细胞在48~72 h出现明显的形态改变和细胞密度降低。

图4 GC多糖对B16-F10黑色素瘤细胞活力、增殖、迁移及形态的影响

        为验证GC多糖对正常皮肤细胞的安全性，作者利用荧光显微镜对GC-1A处理后的HDF细胞进行了详细的形态学分析（图5）。实验使用了四种荧光标记物全面评估细胞健康状态：DAPI标记细胞核（蓝色）以评估核完整性，罗丹明鬼笔环肽标记肌动蛋白骨架（红色）以观察细胞骨架结构，WGA标记细胞膜/糖蛋白（绿色）以检测细胞膜完整性，MitoTracker标记线粒体（青色）以评估线粒体功能。结果显示，GC-1A处理组的HDF细胞形态完好，细胞核形态正常、肌动蛋白骨架排列整齐、细胞膜结构完整、线粒体分布均匀，与未处理对照组（NT）几乎无差异；而LPS阳性对照组细胞形态明显改变，骨架紊乱，呈现细胞应激特征。这一结果从形态学层面证实了GC-1A对真皮成纤维细胞的生物安全性，与其在活力实验中的表现一致。

图5 GC-1A处理后人真皮成纤维细胞（HDF）的荧光显微镜形态分析

        氨基酸代谢谱分析（图6）以饼图形式展示了三种细胞在不同处理条件下的氨基酸相对分布。在巨噬细胞中，GC-1A和GC-2A处理后精氨酸和赖氨酸水平显著升高，同时谷氨酰胺水平降低，对应右侧通路示意图所揭示的精氨酸代谢激活途径——精氨酸作为iNOS的底物促进NO生成，同时推动吞噬活性和促炎细胞因子产生，构成了冷水组分免疫激活的代谢基础。在角质形成细胞中，GC-2A显著富集谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸和脯氨酸，这些氨基酸直接参与能量供给、蛋白合成和胶原生成，从代谢层面解释了GC-2A的促增殖和促伤口愈合活性。在黑色素瘤细胞中，GC-1A和GC-2A处理导致氨基酸代谢紊乱、芳香族氨基酸代谢异常和线粒体应激，最终引发癌细胞毒性，这与选择性抗肿瘤效应高度吻合。

图6 GC-1A和GC-2A处理后三种细胞的氨基酸代谢谱及代谢通路示意图

        脂肪酸分析进一步揭示了脂质重塑在多糖生物活性中的关键作用（图7）。在B16-F10黑色素瘤细胞中，GC-1A处理后单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸增加，但多不饱和脂肪酸（PUFA）完全缺失；而GC-2A则诱导顺式PUFA富集，这些PUFA是促炎脂质介质前体且可诱导铁死亡，可能部分解释了GC-2A更强的抗黑色素瘤活性。在HaCaT角质形成细胞中，GC-1A增加不饱和脂肪酸以支持膜可塑性和迁移；GC-2A则富集长链饱和脂肪酸以增强膜完整性和屏障功能。在RAW264.7巨噬细胞中，GC-1A大幅降低短链饱和脂肪酸，转向棕榈油酸等单不饱和脂肪酸，反映了免疫激活相关的膜重塑和脂质合成增强；GC-2A则呈现更为可控的脂质应答。

图7 GC-1A和GC-2A对不同细胞类型脂肪酸重塑的功能调控示意图

        总之，作者首次系统阐明了红藻Gracilaria corticata来源的硫酸化半乳聚糖通过结构依赖的代谢重编程机制发挥多重生物活性，揭示了两条清晰的构效关系路径：冷水提取组分通过精氨酸代谢通路激活巨噬细胞免疫功能，增强吞噬和NO产生，同时促进成纤维细胞增殖和迁移，并具有显著的抗氧化活性，适合作为免疫增强剂和伤口愈合辅助剂开发。热水提取组分具有双重功能，一方面瞬时激活巨噬细胞后引发代谢耗竭，另一方面选择性杀伤黑色素瘤细胞，同时强力促进正常皮肤细胞增殖和迁移，并通过上调TGF-β1、下调TNF-α和MMP-1加速伤口愈合，在肿瘤治疗和再生医学领域具有更大的转化潜力。该研究突破了传统结构-活性关系研究仅关注受体信号的范式，提出代谢重编程是硫酸化多糖生物活性的重要驱动机制，为海洋多糖的精准开发和靶向应用提供了全新的研究思路。后续可进一步在动物模型中验证其体内疗效，并深入探索多糖结构与代谢靶点之间的分子识别机制。

        原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2026.116692

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作者：付钧

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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